毛細管電泳法PPT介紹

石油人在北京

第22章  毛細管電泳法Capillary Electrophoresis,  CE

毛細管電泳是帶電粒子在電場力的驅動下，在毛細管中按其淌度或和分配系數不同進行高效、快速分離的電泳新技術，也稱為高效毛細管電泳。

  20世紀30－40年代                 蒂塞利烏斯 (A.W.K.Tiselius）建立了移動界面電泳，將電泳發展成分離技術                             獲得1948年諾貝爾化學獎
第22章  毛細管電泳法(Capillary Electrophoresis,  CE)
1   毛細管電泳的原理
2   分離模式
3   進樣與檢測
4   毛細管電泳的應用

第22章  毛細管電泳22－1   毛細管電泳的原理
1 裝置
                   毛細管                   數據處理

     電極                          檢測器
                                              電極
                       試樣
        緩沖液                                                                            緩沖液

                                                 高壓電源
                                              （可高至30KV）
第22章  毛細管電泳                                                                        22－1  毛細管電泳的原理2  電泳和電滲
電泳
是指在電場作用下，溶液中的帶電粒子作定向移動的現象。
電滲
是指在電場作用下，毛細管或固相多孔物質內液體沿固體表面移動的現象。  
第22章  毛細管電泳                                                                        22－1  毛細管電泳的原理2  電泳和電滲
電泳
行為與特性使用淌度描述  即單位場強(E)下離子的平均電泳速度υ
       μep=υ/E
實驗中，只發生電泳時有效淌度
        μef =υef ﹒ (L /V) =( l / tm )﹒(L /V)

       毛細管有效長度      遷移時間
                       毛細管總長度    電壓
第22章  毛細管電泳                                                                        22－1  毛細管電泳的原理2  電泳和電滲
電滲
與固液界面的雙電層有著密切的關系

在毛細管壁雙電層的擴散層中的陽離子，相對于毛細管壁的負電荷表面，形成一個圓筒形的陽離子鞘，在電場作用下，溶劑化了的陽離子，沿滑動面與緊密層作相對運動，攜帶著溶劑一起向陰極遷移，便形成了電滲流（electroosmotic flow ,EOF）。

第22章  毛細管電泳                                                                        22－1  毛細管電泳的原理2  電泳和電滲
電滲流的流型特點



電滲流                 HPLC
塞流                   層流
第22章  毛細管電泳                                                                        22－1  毛細管電泳的原理2  電泳和電滲
電滲流的表示
電滲流的大小可用淌度(μeo)或電滲流系數表示
  μeo =υeo / E = l /( teo﹒E )

電滲流速度  毛細管有效長度
                   電滲流流出時間  電場強度
第22章  毛細管電泳                                                                        22－1  毛細管電泳的原理2  電泳和電滲
電滲流的意義
電泳過程中，伴隨著電滲現象
電滲流的速度比電泳速度快5－7倍
利用電滲流可將正、負離子或中性分子一起向同一方向，產生差速遷移，在一次電泳操作中同時完成正、負離子的分離分析
電滲流是毛細管電泳分離的重要參數
控制電滲流的大小和方向，可提高毛細管電泳分離的效率、重現性、分離度。
第22章  毛細管電泳                                                                        22－1  毛細管電泳的原理2  電泳和電滲
改變電滲流的方法

改變外加徑向電場
改變緩沖液成分和濃度       Zeta電勢
改變緩沖液pH
加入添加劑
改變溫度                                   粘度
表觀電泳淌度 μap
第22章  毛細管電泳                                                                        22－1  毛細管電泳的原理3  分離效率和分離度
分離效率
柱效可以用理論塔板數n表示
            n = (μep+μeo) V l /(2DL)
                毛細管電泳分離的柱效方程
理論塔板高
           H =L / n                                               
       n = 5.54(χ/ W½)2     實驗上可按上式求出理論塔板數
χ為電泳圖上從起點至電泳峰最大值之間的距離
   W½為電泳峰的半高峰寬  
第22章  毛細管電泳                                                                        22－1  毛細管電泳的原理3  分離效率和分離度
分離度
電泳中兩峰的分離度（Rs），也稱為分辨率，它表示了淌度相近的組分分開的能力，可表達為
           Rs= （n 1/2/4）×（ Δυ /υ平 ）
Δυ相鄰兩區帶的遷移速度差
υ平為兩者的平均速度
Δυ / υ平表示分離選擇性
n為柱效

分離度計算式

Rs = 2 (tm2 - tm1 ) / ( W1 + W2 )

tm1、tm2   分別為兩個組份的遷移時間
W     為峰底的寬度

第22章  毛細管電泳                                                                        22－1  毛細管電泳的原理4  區帶寬度及其展寬因素
區帶寬度

       Ws =（Wt﹒l/tm）-Wd

第22章  毛細管電泳                                                                        22－1  毛細管電泳的原理4  區帶寬度及其展寬因素
區帶寬度展寬因素
焦耳熱
進樣
電泳擴散
毛細管壁對組分的吸附


焦耳熱   





       細內徑（<100μm），粗外徑的毛細管柱

進樣
              試樣導入毛細管柱時，總有一定的試樣區帶長度。
          細內徑的毛細管柱時，進樣操作的要求更為嚴格。
                                      一般進樣區帶控制在柱長的1%

電泳擴散            
               試樣區帶中的緩沖溶液濃度或電阻率與毛細管其它地方的濃度或電阻率不相等時，因兩個區域電場強度的差異，而引起區帶電分散。
                        μs---μb


毛細管壁對組分的吸附  
      電泳峰拖尾或變形，甚至消失。
抑制吸附作用常用的方法有：
●使用極端pH條件
●加入中性鹽或兩性離子化合物
●對毛細管內壁進行涂層處理
    需要注意：方法也會抑制或改變電滲流
第22章  毛細管電泳                                                                        22－2  分離模式
1  毛細管區帶電泳
2  膠束電動色譜
3  毛細管凝膠電泳
4  毛細管等速電泳
5  毛細管等電聚焦
6  毛細管電色譜

第二十二章  毛細管電泳                                                                                 22－2  分離模式1  毛細管區帶電泳
CZE   也稱為毛細管自由溶液區帶電泳
毛細管電泳中最基本的操作模式，應用最廣泛，是其它各種操作模式的母體
第22章  毛細管電泳                                                                                         22－2  分離模式2  膠束電動色譜
          電動色譜:是以電滲流驅動的一種色譜技術
膠束電動色譜  MEKC:是以膠束為假固定相的一種電動色譜，是電泳技術和色譜技術的結合

膠束電動色譜的應用特點:
使毛細管電泳不僅能分離離子化合物，而且還能分離中性化合物.
比高效液相色譜更為高效.
    HPLC 分離柱效為5000－25000理論板數/m
    MEKC 可達到50000－500000理論板數/m
比高效液相色譜更為高速.MEKC分離時間通常小于30min，但達到相仿效率的毛細管LC，需要更長的時間。

第22章  毛細管電泳                                                                                 22－2  分離模式3  毛細管凝膠電泳
CGE 是毛細管自由溶液區帶電泳派生出的一種電泳方式
    用多孔性的凝膠或其它篩分劑作介質，網狀結構，按分子的大小分離

毛細管凝膠電泳綜合了電泳技術和平板凝膠電泳的優點 :
電泳峰尖銳，柱效極高
短柱上實現極好的分離
試樣容量為10－12g
主要缺點:制備柱較困難，壽命較短
已成為分離分析生物大分子如蛋白質、多肽、核  酸、DNA等強有力的工具。例應用CGE分離與激光誘導熒光檢測相結合，用于DNA序列快速分析。

第22章  毛細管電泳                                                                                             22－2  分離模式   4  毛細管等速電泳
分離是建立在試樣中各組分的電泳淌度不同，等速電泳中被分析試樣進樣前后分別使用前導電解質溶液和終結電解質溶液，分離后的各組分區帶以相同的電泳遷移速度通過檢測窗口。


注意:
前導電解質的電泳淌度應高于試樣中各組分的電泳淌度，而終結電解質的電泳淌度則反之。
電泳過程中被分離各組分的濃度都將接近前導電解質濃度，對痕量組分在柱上濃縮可達幾個數量級，成為重要的柱上濃縮技術之一。

第22章  毛細管電泳                                                                                           22－2  分離模式5  毛細管等電聚焦
CIEF:
     建立在不同蛋白質或多肽之間等電點（pI值）差異基礎上的分離方法。
蛋白質的等電點(pI):
    指蛋白質分子的表觀電荷數為零時的pH值。

方法:       進樣－等電聚焦－檢測
先將脫鹽的試樣（蛋白質）以≥1％的濃度與兩性電解質溶液混合，用壓力進樣充入毛細管柱(陽極端)，置于陽極電解質溶液如H3PO4中，檢測端為陰極端，置于陰極電解質如NaOH中。
施加電壓，進行電泳實驗。兩性電解質離子形成pH的位置梯度，而蛋白質在遷移時會在其等電點的pH區域內停止移動。這樣pI不同的蛋白質各組分會在毛細管內很窄的不同pH區域內聚焦.
在陽、陰極電解液中加入鹽如NaCI或NaOH,破壞pH梯度，使各組分蛋白質重新帶電，在電場力作用下發生遷移、檢測，使不同組分的蛋白質得到分離。

特點:
等電聚焦實際上也是一個試樣濃縮過程，這一過程可用于濃縮試樣組分。
具有極高的分辯率，可以分離等電點相差0.01pH的兩種蛋白質.

注意:電滲流的存在會破壞聚焦區帶的穩定
第22章  毛細管電泳                                                                                           22－2  分離模式6  毛細管電色譜
CEC:以電滲流驅動流動相，
      開管和填充兩種

比高效液相色譜具有更高的柱效  
第22章  毛細管電泳                                                                               22－3   進樣與檢測
1  進樣方法
電動進樣  也稱電遷移進樣.
   方法:將毛細管的進樣端插入裝有試樣溶液的試樣管中，試樣管中插入電極，與檢測端的緩沖液間施加進樣電壓，并維持一定時間，試樣溶液在電泳和電滲流作用下進入毛細管，然后再將試樣溶液換成載體緩沖液，電泳即可進行。
第22章  毛細管電泳                                                                                        22－3   進樣與檢測 1  進樣方法
流體動力學進樣
           也稱為虹吸進樣、重力進樣、壓差進樣
方法:毛細管進樣端插入試樣溶液容器，通過進樣端加壓，或檢測端出口減壓，或調節進樣端試樣溶液液面大于出口端緩沖液液面高度，利用虹吸現象，使進樣口端與出口端形成正壓差，并維持一定時間，試樣在壓差作用下進入毛細管進樣端，再把進樣端放回緩沖液液槽中，進行電泳  
第22章  毛細管電泳                                                                                  22－3   進樣與檢測 2  檢測方法


第二十二章  毛細管電泳                                                                           22－3   進樣與檢測 2  檢測方法
檢測器                      檢出限（mol/L）                   特    點

UV－可見吸收                     10-5－10-6                近似通用，常規應用
熒光
       非相干光誘導              10-7－10-8               靈敏，但試樣通常要衍生
         激光誘導                      10-10－10-12           高靈敏度，價格昂貴，要衍生化
電化學
    電導                              10-5－10-7                  通用性
        安培                               10-8－10-9               選擇性，靈敏度高，微量

質譜                                     10-7－10-9              儀器復雜，可獲結構信息，
                                                                                       質量靈敏度高

放射                                      10-9－10-11               靈敏度高，操作有特殊要求

第22章  毛細管電泳                                                                             22－4  應用
陣列毛細管凝膠電泳分析DNA序列

           硬件由十六條毛細管組成陣列         用氬激光激發熒光檢測
               CCD檢測器接收熒光

     可以進行連續地大規模地基因測量
 《毛細管電泳法》結束

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