基金申請的策略和技巧

大宇

基金申請的策略和技巧
黎 明 濤

中山大學蛋白質組學研究中心
中山大學基礎醫學院藥理教研室

基金申請
選題

撰寫申請書

答辯
撰寫前的準備
好心情、好身體  邊想邊寫  3h /天
讀指南、讀通知  注意截止期
讀標書、讀高手、讀同行
讀自己  賣點！？選題 創新性 工作基礎
想法變文字  一氣呵成   “立項依據”
溝通 科研科87330567、醫科處 87333055

摘  要    研究內容和意義（限400字）
1. 基礎：繼續和深入 發表和未發表 創新
2. 問題 中肯
3. 預實驗 針對“問題”的預實驗結果
4. 假設 思想性、創新性
5. 方法 可靠性第一 先進性第二
6. 目標 明確、具體
7. 意義 理論性和應用性
立  項  依  據
1. 關鍵! 占50% 文筆流暢、層次分明、邏輯性強
2. 要求：充分的理由和意義 思想性 與摘要呼應
3. 自己的工作為依據  圖文并茂 規范
4. 參考文獻  時效性 自己的文章 規范化
5. 深入淺出  內行、外行讀得懂  
6. 人文文化  素質 精神 動人的故事


神經元凋亡時SP1對BH3-only蛋白Bim的轉錄調控
細胞凋亡    時SP1對BH3-only蛋白Bim的轉錄調控
神經元凋亡時           BH3-only蛋白Bim的轉錄調控
神經元凋亡時SP1對BH3-only蛋白Bim的        調控
                        SP1對BH3-only蛋白Bim的轉錄調控
                        SP1對神經元凋亡的調控作用

關鍵詞：SP1/Bim /基因調控/信號轉導/神經元凋亡

研究內容、研究目標與擬解決的關鍵問題
神經元凋亡時SP1對BH3-only蛋白Bim的轉錄調控
研究目標
獲得SP1直接調控bim基因表達的可靠證據，闡明促凋亡蛋白Bim由SP1轉錄調控的新機制，為確立SP1作為神經退行性疾病治療的新靶點提供更充分的科學依據。
要求：明確、具體  解決學術問題

   研究內容 （緊緊圍繞研究目標）
      1.  證明bim啟動子核心區的SP1結合序列是否介導了bim基因的上調   為了證實bim啟動子核心區的SP1結合序列是否介導了bim基因的上調，將其中的SP1結合序列進行點突變，使其不能結合SP1；確定這一突變是否能夠消除bim啟動子的撤鉀反應。
     2.  分析SP1 是否能夠與bim啟動子核心區的SP1結合序列結合  應用EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay)技術，證實bim啟動子核心區的SP1 結合序列是否能夠與SP1結合；進一步采用CHIP(Chromatin immunoprecipitation)方法，獲得SP1與bim啟動子核心區在細胞內結合的證據。
     3.  從 bim 的mRNA 和蛋白質水平，觀察負顯性SP1是否能夠抑制撤鉀誘導的bim基因的上調  質粒轉染CGNs的轉染率只能達到0.1-1.0 %，腺病毒的感染率可達70－80%[1]。 因此，構建dnSP1的腺病毒載體Ad-dnSP1，感染CGNs才能達到可靠分析bim的mRNA和蛋白質表達水平改變的目的。
  4. 分析SP1誘導Bim這一機制對神經元凋亡的調控作用  確立SP1轉錄激活bim這一機制后，進一步分析這一機制對神經元凋亡的調控作用。

   擬解決的關鍵問題    獲得SP1直接調控bim基因表達的可靠依據。

    什么是關鍵問題？
     — 研究過程中對達到預期目標有重要影響的某些研究內容或因素。
     — 為達到預期目標所必須掌握的關鍵技術或研究手段。



            研  究  方  案
項目需求為前提；
可靠性第一，先進性第二；
參考文獻；
突出關鍵技術的描述；
不主張使用流程圖，建議開頭：“有關方法、技術路線、試 驗手段、關鍵技術綜述如下……”。


可行性分析              －從學術思想角度提出
         1.  工作基礎 （學術思想）
        2.  科研梯隊
        3.  實驗條件
        4.  實驗技術
        5.  交流與合作（國內、國外）


  研究基礎與工作條件   —突出與項目相關的工作積累
研究基礎 已取得的研究工作成績及與本項目有關的研究工作積累(對于自由申請項目，著重填寫申請人近期的主要工作業績；對于重點項目，請著重填寫本課題組與本項目相關的研究工作積累和近五年的主要研究業績)
工作條件 已具備的實驗條件，尚缺少的實驗條件和擬解決的途徑(包括利用國家重點實驗室和部門開放實驗室的計劃與落實情況)
研究 基 礎
     在國家自然科學基金(已結題三項、正進行一項)的資助下，近五年有如下工作積累和成績：

    1.   SCI論文   近五年發表了14篇SCI論文；其中與神經元凋亡的信號轉導和基因調控有關的論文，作為第一作者的有2篇，作為通訊作者的有4篇(見后)，作為共同作者的有8篇。

  2.  Bim轉錄機制的前期工作  我們首次報道了神經元凋亡時JNK/c-Jun不參與bim的上調[1]，隨后，我們又以可靠的證據揭示了PI3K/Akt/ FKHRL1也不介導bim的上調(未發表資料)。這些研究工作改變了以往的觀點,也是本項目重要的立項依據之一。


SCI 文  章
1.        Leyu Shi , Shoufang Gong, Zhongmin Yuan , Chi Ma, Yanling Liu, Chuanfu Wang , Wenming Li, Rongbiao Pi, Shoujian Huang, Ruzhu Chen , Yifan Han , Zixu Mao, and  Mingtao Li(通訊作者). Activity deprivation-dependent induction of the proapoptotic BH3-only protein Bim is independent of JNK/c-Jun activation during apoptosis in cerebellar granule neurons. Neurosci Lett. 2005, 375：7－12.
2.       Wenya Wang, Chi Ma, Zixu Mao and Mingtao Li. (通訊作者). JNK inhibition as a potential strategy in treating Parkinsons’s disease. Drug News Perspect, 2004, 17(10):646-54.
3.       Wenya Wang, Leyu Shi, Yuanbin Xie, Chi Ma, Wenming Li, Xingwen Su, Shoujian Huang, Ruzhu Chen, Zhenyu Zhu, Zixu Mao, Yifan Han and Mingtao Li. (通訊作者). SP600125, a new JNK inhibitor, protects dopaminergic neurons in the MPTP model of Parkinson’s disease.  Neurosci Res  2004；48:195-202
4.      Yuanbin Xie, Yanling Liu, Chi Ma, Zhongmin Yuan, Wenya Wang, Zhenyu Zhu, , Guoquan Gao, Xianguo Liu, Hengxin Yuan, Ruzhu Chen, Shoujian Huang, Xuelan Wang, Xiaonan Zhu, Xuemin Wang, Zixu Mao and Mingtao Li (通訊作者). Indirubin-3′-oxime inhibits c-Jun NH2-terminal kinase: anti-apoptotic effect in cerebellar granule neurons. Neurosci Lett. 2004, 367:355-359.

5.     Rongbiao Pi, Wenming Li Nelson T.K.Lee, Hugh H.N.Chan, Yongmei Pu, Ling Nga Chan, Nikolaus J.Sucher, Doanld C. Chang, Mingtao Li and Yifan Han. Minocycline prevents glutamate-induced apoptosis of cerebellar granule neurons by differential regulation of p38 and Akt pathways. J Neurochem. 2004, 91:1212-1230. Wenya Wang, Chi Ma, Zixu Mao and Mingtao Li. (通訊作者). JNK inhibition as a potential strategy in treating Parkinsons’s disease. Drug News Perspect, 2004, 17(10):646-54.
6.     Wenming Li, Rongbiao Pi, Hugh H. N. Chan, Hongjun Fu, Nelson T. K. Lee, Hing Wai Tsang, Yongmei Pu, Donald C. Chang, Chaoying Li, Jialie Luo, Keming Xiong, Zhiwang Li, Hong Xue, Paul R. Carlier, Yuanping Pang, Karl W. K. Tsim, Mingtao Li and Yifan Han. Novel dimeric AChE inhibitor Bis(7)-tacrine, but not Donepezil, prevents glutamate-induced neuronal apoptosis by blocking NMDA receptors. J Biol Chem. 2005, 280(18):18179-88.
7.     Xuemin Wang, Xiaoli Tang, Mingtao Li, John Marshall, Zixu Mao. Regulation of neuroprotective activity of myocyte enhancer factor 2 by cAMP-PKA signaling pathway in neuronal survival. J Biol Chem. 2005, 280(17):16705-13.
8.     Marcus Wiedmann, Xuemin Wang, X.iaoli Tang, Mingtao Li, Zixu Mao. PI3K/Akt-dependent regulation of the transcription factor myocyte enhancer factor-2 in insulin-like growth factor-1- and membrane depolarization-mediated survival of cerebellar granule neurons. J Neurosci Res. 2005 2005 81(2):226-234.


9.      Mingtao Li，Xiaomin Wang，Mary Kay Meintzer，Tracey Laessig，Morris J. Birnbaum and Kim A. Heidenreich.   Cyclic AMP promotes neuronal survival by phosphorylation of glycogen synthase kinase 3β. Mol Cell Biol. 2000, 20（24）：9356-9363.
10.    Mingtao Li，Daniel A. Linsenman，Melissa P.Allen，Mary Kay Meintzer， Xiaomin Wang，Tracey Laessig，Margaret E. Wierman & Kim A. Heidenreich. MEF2A and MEF2D undergo phosphorylation and caspase-mediated degradation during apoptosis of rat cerebellar granule neurons. J. Neurosci. 2001; 21(17):6544-6552.
11.   Daniel A. Linseman, Christopher M. Bartley, Shoshona S. Le, Tracey A. Laessig, Ron J. Bouchard, Mary Kay Meintzer, Mingtao Li and Kim A. Heidenreich . Inactivation of the Myocyte Enhancer Factor-2 Repressor Histone Deacetylase-5 by Endogenous Ca2/Calmodulin-dependent Kinase II  Promotes  Depolarization-mediated Cerebellar Granule Neuron Survival. J Biol Chem  2003, 278:41472–41481.
12.   Jing-Ping Yun, Choong-Tsek Liew, Eng Ching Chew, Xiao-Yu Yin, Paul Bo San Lai, Yam Hin Fai, H.K. Richard Li, Mei-Lin Jin, Ming-Xiao Ding, Mingtao Li, Han-Liang Lin, and Wan Yee Lau. Nuclear Matrix Protein Expressions in Hepatocytes of Normal and Cirrhotic Rat Livers Under Normal and Regenerating Conditions.  J Cell Biochem. 2004, 91:1269–1279.


13.  Hongwei Yang, Xiaodong Hu, Hongmei Zhang, Wenjun Xin, Mingtao Li, Tong Zhang,   Lijun Zhou and Xianguo Liu. Roles of CaMKII, PKA, and PKC in the induction and mainternance of LTP of C-fiber-evoked field potentials in rat spinal dorsal horn. J Neurophysiol. 2004, 91: 1122-1133.
14 .  Nengwei Hu, Hongmei Zhang, Xiaodong Hu , Mingtao Li, Tong Zhang,  Lijun Zhou and Xianguo Liu. Protein Synthesis Inhibition Blocks the Late-Phase LTP of C-Fiber  Evoked Field Potentials in Rat Spinal Dorsal Horn. J Neurophysiol, 2003;89:2354- 2359
15 .  Juan Sun, Mingtao Li, Jiahuai Han and Jun Gu. Sensitization of differentiated PC12 cells to apoptosis by presenilin-2 is mediated by p38. Biochem. Biophy. Res. Commun., 2001, 287: 536-541.
16.   Weibin Cai, Jianfang Ma , Chaoyang Li, Zhonghan Yang, Xia Yang, Wei Liu , Zuguo Liu , Mingtao Li, Guoquan Gao. Enhanced anti-angiogenic effect of a deletion mutant of plasminogen kringle 5 on neovascularization. J Cell Biochem. 2005 Sep 15;(in press).
17.   Ming YANG, Cun-you WAGN, Feng ZHOU, Jing TAO, Tao LIU, Hai-yan WEI, Wei LIU, Ming-tao Li, Xian-song FENG.  Proteomic Analysis in the Early Process of Pancreatic Regeneration in the Pancreatectomized Rat.  Acta Pharmacologica Sinica 2005 (in press)
工 作 條 件
         2001年回國，獲得211基金180萬元，組建了一流的分子、細胞生物學實驗室。2002年，作為負責人獲得一期985學科建設經費700萬元，籌建了一流的蛋白質組學實驗室并正在主持開展蛋白質科學的前沿性工作。近三年，培養和匯聚了一支從事分子神經生物學和蛋白質組學研究的科研隊伍。 這些建設性工作為解決細胞信號轉導、基因調控以及本項目的核心問題奠定了扎實的基礎。
      項目負責人黎明濤所在單位——中山大學基礎醫學院藥理教研室是211項目資助學科和國家重點學科。人才濟濟，科研裝備精良。近三年，藥理教研室獲得學科建設資金3000萬元，已購置大型儀器如質譜儀、激光共聚焦顯微鏡、超速離心機、流式細胞儀、高效液相和蛋白質分離純化系統等。這是申請者視為非�？少F的研究工作環境。
申請者簡歷
申請者和項目組主要成員
學歷
研究工作簡歷
近期已發表與本項目有關的文章目錄
獲得學術獎勵情況
在本項目中承擔的任務。


   黎明濤 (Li Mingtao)
              項目負責人，中山大學基礎醫學院藥理教研室教授，博士生導師，中山醫學院蛋白質組學實驗室主任。于1984年、1989年和1996年分別獲得醫學學士、碩士和博士學位。
              主要研究領域是神經元凋亡的信號轉導、基因調控和蛋白質組學。在美國Department of Pharmacology, University of Colorado Health Sciences Center從事兩年博士后研究（1999-2001），主攻凋亡的信號轉導、基因調控和蛋白質組學。
              近五年發表了14篇SCI論文，其中：作為第一作者，在國際核心雜志Molecular and Cellular Biology(Impact Factor, 10.03)和 Journal of Neuroscience(IF, 8.4)發表了具有創新性的文章；作為通訊作者，最近在Neurosci Res(IF, 2.4) 和Neurosci Lett（IF，2.2）等期刊上發表了開拓性的文章。近五年（1998－2004）作為第一主持人獲得13項基金，包括：4項國家自然科學基金；5項省自然科學基金；3項市基金；1項教育部基金。
    發表的相關論文
      1. Leyu Shi , Shoufang Gong, Zhongmin Yuan , Chi Ma, Yanling Liu, Chuanfu Wang , Wenming Li, Rongbiao Pi, Shoujian Huang, Ruzhu Chen , Yifan Han , Zixu Mao, and  Mingtao Li(通訊作者). Activity deprivation-dependent induction of the proapoptotic BH3-only protein Bim is independent of JNK/c-Jun activation during apoptosis in cerebellar granule neurons. Neurosci Lett. 2005, 375:7－12.
   2. ……
   3. ……


     皮榮標(Pi Rongbiao)
               33歲，博士學位，講師。2002年畢業于中山大學，獲神經藥理學博士。同年赴香港科技大學生物化學系從事博士后研究，現在中山大學藥學院任講師。主要研究興趣涉及神經保護藥物的作用及其機制的研究。曾負責或參加包括國家自然科學基金等多項研究。已發表或待發表論著近20篇，其中SCI論文5篇。
              皮博士與本人合作達11年，有共同的研究趣向，作為共同作者發表多篇SCI論文。他掌握了本項目涉及的大部分實驗方法和技術，尤其在腺病毒載體構建方面積累了經驗（見文章）。主要負責腺病毒載體構建等工作。
     發表的相關論文
      1. Rongbiao Pi, Wenming Li, Nelson T.K.Lee, Hugh H.N.Chan, Yongmei Pu, Ling Nga Chan, Nikolaus J. Sucher, Doanld C. Chang, Mingtao Li and Yifan Han. Minocycline prevents glutamate-induced apoptosis of cerebellar granule neurons by differential regulation of p38 and Akt pathways. J Neurochem. 2004, 91:1212-1230.
     2. ……
     3. ……


申請項目同行評議意見反饋信
     黎明濤先生：   
             您好！您申請的項目經專家投票表決，同意資助。關于你的項目的同行評議意見如下： 1.    本項目在小腦顆粒細胞撤鉀的離體凋亡模型中，發現了一種直接調節Bim的新轉錄因子SP1，申請人試圖采用腺病毒轉染技術、基因突變以及分子生物學方法進一步論證SP1是直接調控bim基因的這一假說。立項具有前言性，申請人工作基礎好，并與美國Emory大學、香港大學有長期的合作條件，完全能夠完成本項課題。建議優先資助。 2.    本項課題的立項依據較為充分，具有一定的學術創新及科學意義。研究內容明確、技術路線清晰、研究方法和方案可行。申請者有較高的學術水平，以及多次主持國家自然科學基金課題的經驗。同時，申請者所在單位又有比較好的實驗室及條件。建議給予資助。 3.    課題研究具有較好的工作基礎，研究具有較高的學術價值，建議資助。 4.    同意資助。理由：該項目立論依據充分，其重要的意義表現在澄清撤鉀誘導神經元凋亡時，Bim上調的細胞內信號轉導機制。申請者有較好的研究基礎和研究能力，項目的內容設置合適，重點突出，總體方案合理，技術路線可行，可資助。 5.     This is a nicely writen proposal with a clear aim and practical approaches. Further, the group has published results related to the current proposal, indicating the ability of the group to perform the experiments. 
獲得資助的決定因素
工作基礎好
學術創新性及學術價值
立項依據充分
研究內容明確
技術路線清晰
重點突出、方案合理
國際合作

祝大家新年快樂！  在新的一年獲得更多基金！
基金答辯
充滿自信、激情
儀表和體語
特點： 專家心理？按提前結束做準備！
準備充分     幻燈 小道具
口頭表達     準確性、情感性、可信性和簡明性
開門見山、突出主題    做什么？為什么？怎樣做？
突出特色和創新


帕金森病治療的新靶點及靛玉紅衍生物的研究與開發
黎   明   濤
中山大學基礎醫學院



以JNK為靶治療PD
1. 保護多巴胺能神經元

2. 改善行為學指標

3. 提高黑質多巴胺濃度



以JNK/CDK5/GSK3β為靶治療PD
       JNK          Neurosci Res 2004, 48:195-202
                                     Drug News Perspect.2004 17(10):646-54
       GSK3β   Mingtao Li, et al,  unpublished data
           CDK5      PNAS USA 2003,100(23):13650-5

抑制JNK/CDK5/GSK3β的方案
   1.三種抑制劑聯合
   2.一種抑制劑，“一石三鳥”

Indirubin-3'-oxime（靛玉紅衍生物）
是CDK5、GSK-3β的抑制劑
Nat Cell Biol. 1999 1(1):60-7
J Biol Chem. 2001, 5;276(1):251-60





研究目標

   以JNK/CDK5/GSK3β為明確靶點，以靛玉紅衍生物為抑制劑, 研發出一類毒性小、特異性高、作用強的治療PD的新藥物
研究內容
1. 篩選對JNK具有特異性抑制作用的靛玉紅衍生物 (11個）
2. 篩選對黑質多巴胺神經元凋亡具有保護性干預作用的靛玉紅衍生物 （8個）
3. 篩選對PD具有治療作用的衍生物 （4個）
4. 藥理、毒理研究
研究基礎
1. 首次證實JNK是治療PD的有效靶點
2.  證實GSK-3β是治療PD的靶點之一
3. 發現靛玉紅衍生物能夠抑制JNK，對PD具有治療作用
4. 15篇相關SCI文章

發表文章補充
Wiedmann M, Wang X, Tang X, Han M, Li M, Mao Z.         J Neurosci Res. 2005 Jun 1 [Epub ahead of print]
Wang X, Tang X, Li M, Marshall J, Mao Z.  J Biol Chem. 2005, 280(17):16705-13.
Li W, Pi R, Chan HH, Fu H, Lee NT, Tsang HW, Pu Y, Chang DC, Li C, Luo J, Xiong K, Li Z, Xue H, Carlier PR, Pang Y, Tsim KW, Li M, Han Y.   J Biol Chem. 2005, 280(18):18179-88.
創 新 點
       1. 首次證實JNK是治療PD的有效靶點
       2.  證實GSK-3β是治療PD的靶點之一
       3. 發現靛玉紅能夠抑制JNK，對PD具有治療作用
       4. JNK/CDK5/ GSK-3β為靶治療PD
       5. 用一種化合物抑制JNK/CDK5/ GSK-3β



我們對完成此項目充滿信心！
謝   謝！

參 考 文 獻
1.  Leyu Shi , Shoufang Gong, Zhongmin Yuan , Chi Ma, Yanling Liu,Chuanfu Wang , Wenming Li, Rongbiao Pi, Shoujian Huang, Ruzhu Chen , Yifan Han , Zixu Mao, and  Mingtao Li. Activity deprivation-dependent induction of the proapoptotic BH3-only protein Bim is independent of JNK/c-Jun activation during apoptosis in cerebellar granule neurons. Neurosci Lett. 2005, 375：7－12.
2. Wenya Wang, Leyu Shi, Yuanbin Xie, Chi Ma, Wenming Li, Xingwen Su, Shoujian Huang, Ruzhu Chen, Zhenyu Zhu, Zixu Mao, Yifan Han and Mingtao Li. SP600125, a new JNK inhibitor, protects dopaminergic neurons in the MPTP model of Parkinson’s disease.  Neurosci Res  2004；48:195-202
實事求是、追求真理的人文精神
             Dr. Jonathan Ham以撤NGF的交感神經元為模型觀察到JNK/c-Jun[10]和PI3K/Akt/ FKHRL1通路參與Bim的上調[12]，而我們以撤鉀處理CGNs為模型觀察到，這兩條通路不參與Bim的上調。顯然，我們的研究結果不支持Dr. Ham的結論。但是，Dr.  Ham讀了我們的文章初稿之后，在提出中肯意見的同時，稱我們的實驗結果非常清楚并對我們的上述結論表示認同(Overall your results are clear and suggest that altering the KCl concentration in CGNs induces the bim promoter by a mechanism that does not involve JNK / c-Jun or FOXO factors)。Dr.  Ham這種嚴謹的科學態度令人欽佩，值得學習（尊敬的評審專家，如有必要，本人可以將Dr. Ham的Email原件轉發給您）。

工作基礎 ：   
          本項目是在原工作基礎上的繼續和深入。近五年，本人共發表了12篇SCI論文，其中作為第一作者兩篇；通訊作者四篇（見工作基礎）。研究方向主要集中在神經元凋亡的信號轉導和基因調控。本課題組在研究JNK/c-Jun通路靶基因時,發現“促凋亡蛋白bim上調不依賴JNK/c-Jun”。我們首次報道了神經元凋亡時JNK/c-Jun不參與bim的上調[1]，隨后，我們又以可靠的證據揭示了PI3K/Akt/ FKHRL1也不介導bim的上調(未發表資料)。最近，對bim的調控研究又取得了突 破性的進展，即發現了SP1調控bim的轉錄機制(見立項依據)。這些研究工作改變了以往的觀點,也是本項目重要的立項依據之一。因此，我們具有完成本項目的切實可行的、扎實的前期工作基礎。


負顯性SP1腺病毒(Ad-dnSP1)載體的構建、擴增、純化和保存
基本方法

      大鼠小腦顆粒神經元培養、Western blot、RT－PCR、鈣磷沉淀法轉染基因、轉基因神經元的凋亡分析、報道基因表達分析、免疫沉淀等基本方法均按我們報道[1, 2, 3, 4, 5, 6]的進行。